بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش SDS-PAGE

بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش  SDS-PAGE

بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش SDS-PAGE

 

 

چکیده
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل میباشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال 1993، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوشهای مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مايکوباکتريوم بوويس به عنوان عامل سل گاوي به صورت موردي انسان را نيز درگير مي کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب میشود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتیژنهای باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شدهاند.
جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونههای ارسالی 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونههای کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریومها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونیها در محیط میدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونیهای جدید، به منظور استخراج پروتئینهای ترشحی و غشایی از روشهای سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.
با بررسی باندهای حاصله از پروتئینهای غشایی و ترشحی در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئینهای غشایی باندهایی در محدوده 15 تا 85 کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از 15 تا 120 کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدودههای وزنی تقریبا 30 تا 116 کیلو دالتون بسیار متفاوت بودهاند.
در بررسی پروتئینهای ترشحی در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده 15 تا 115 کیلودالتون و در سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از 18 تا 114 کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدودهها مشاهده شد.
نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئینهای سویههای مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس میتواند مرجعی برای بررسیهای بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.
به نظر میرسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویههای حساس و بوویس با به کارگیری روشهای مناسب میتواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویههای حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.
فهرست مطالب
چکیده 1
فصل اول- مقدمه 3
1-1. کلیات سل 4
1-2. بیان مسئله 5
1-3. اهمیت و ضرورت 7
1-4. اهداف 8
فصل دوم- پیشینه تحقیق 9
2-1. تاریخچه 10
2-2. مايکوباکتريومها 11
2-3. طبقهبندي مايکو باکتريومها 12
2-3-1. فتو کروموژن 13
2-3-2. اسکوتوکروموژن 13
2-3-3. غیر کروموژن 14
2-3-4. سریع الرشد 14
2-4. باکتریولوژی سل 14
2-5. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی 15
2-6. خصوصیات رشد 16
2-7 . فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 17
2-7-1. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی 18
2-7-2. انتقال توسط غشاء داخلی 18
2-7-2-1. انتقال ترکیبات حاوی کربن 18
2-7-2-2. انتقال ترکیبات غیر کربن 19
2-8. فاکتورهای ویرولانس 20
1-9. ديواره سلولي 21
2-10. بیوشیمی دیواره سلولی 23
2-11. بيماريزايي 23
2-11-1. مکانیسم بیماریزایی 25
2-12. درمان سل 26
2-12-1. درمان سل حساس به دارو 26
2-12-2. درمان سل مقاوم به دارو 26
2-13. مقاومت دارويي مايكوباكتريوم توبركلوزيس 27
2-14. مکانیسم مولکولی مقاومت دارویی 28
2-14-1. مقاومت به ريفامپين 28
2-14-2. مقاومت به ایزونیازید 29
2-14-3. مقاومت به پيرازين آميد 29
2-14-4. مقاومت به اتامبوتول 30
2-14-5. مقاومت به استرپتومايسين 30
2-14-6. فلورو کینولونها 30
2-14-7. آمینوگلیکوزیدها 31
2-14-8. سیکلوسرین 31
2-14-9. پاراآمینوسالیسیلیک 32
2-15. انواع سل 33
2-15-1. سل ریوی 33
2-15-2. سل خارج ریوی 33
2-15-2-1. سل عقدههای لنفاوی 33
2-15-2-2. سل پلور 34
2-15-2-3. سل استخوانی 34
2-15-2-4. سل سیستم عصبی مرکزی 34
2-15-2-5. سل شکمی 34
2-15-2-6. سل دستگاه تناسلی 35
2-15-2-7. سل پریکاردیت 35
2-15-2-8. سل ارزنی 35
2-16. سل در کودکان 36
2-17. سل و ایدز 36
2-18. روشهای تشخیص سل 37
2-18-1. تست پوستی 37
2-18-2. کشت 37
2-18-3. تهیه اسمیر 38
2-18-4. تکنیک PCR 38
2-18-5. بررسی اینترفرون گاما 38
2-18-6. رادیوگرافی ریه 39
2-19. اپيدميولوژي 39
2-19-1. وضعیت بیماری سل انسانی در ایران 41
2-20. مایکوباکتریوم بوویس 44
2-20-1. اهميت سل گاوي 45
2-21. مایکوباکتریوم بوویس ب.ث.ژ 45
2-21-1. فیلوژنی 45
2-21-2. تاریخچه BCG 48
2-21-3. تاریخچه تولید و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ایران 50
2-21-4. ایمنیزایی 51
2-21-5. لزوم طراحی واکسن جدید 52
2-22. پروتئومیکس مایکوباکتریومها 53
2-23. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس 58
فصل سوم- مواد و روشها 61
3-1. نمونهگیری 63
3-2. کشت و جداسازی باکتری 64
3-2-1. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان 5/1 لیتر 64
3-2-2. طرز تهیه محیط کشت 64
3-2-3. آلودگیزدایی و تغلیظ نمونهها 65
3-2-3-1. آماده سازی محلولها 66
3-2-4. روش کار کشت 66
3-2-4-1. محیط کشت حاوی تیوفن 2- کربوکسیلیک اسید هیدرازید 67
3-3. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریومها 67
3-3-1. تهیه گستره 67
3-3-2. رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O 68
3-3-3. رنگآمیزی ذیل- نلسون 69
3-3-4. رنگآمیزی کینون (رنگآمیزی سرد) 70
3-3-5. بررسی و آزمایش گسترش 71
3-4. بررسی لولههای کشت 71
3-5. شناسایی و تعیین هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس 72
3-5-1. تست نیاسین 77
2-5-1-1. معرفها و مواد لازم تست نیاسین 72
3-5-1-2. آمادهسازی محلولها ی نیاسین 72
3-5-1-3. مراحل کارتست نیاسین 73
3-5-2. آزمونهای احیای نیترات 73
3-5-2-1. معرفها و مواد لازم تست نیترات 73
3-5-2-2. آمادهسازی معرفهای تست نیترات 74
3-5-2-3. مراحل انجام کار تست نیترات 74
3-5-2-4. استانداردهای احیاء نیترات 74
3-5-3. تست کاتالاز 75
3-5-3-1. محیط و مواد مورد نیاز 76
3-5-3-2. آمادهسازی محلولهای تست کاتالاز 76
3-5-3-3. مراحل انجام آزمایش روش نیمه کمی کاتالاز و کاتالاز 68 درجه 76
3-5-3-4. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز 77
3-5-4. حساسیت به تیوفن 2- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH) 77
3-6. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریومها 77
3-6-1. تهیه محلول استاندارد مک فارلند 78
3-6-2. تهیه سوسپانسیون باکتری 78
3-7. کشت سویههای انتخابی در محیط میدل بروک 7H9 78
3-7-1. مواد مورد نیاز 78
3-7-1-1. آمادهسازی محیط 78
3-7-1-2. انتحاب سویهها و کشت 80
3-8. جمعآوری سویهها میکروبی، استخراج و خالصسازی پروتئین 80
3-8-1. استخراج پروتئینهای غشایی 80
3-8-1-1. مواد مورد نیاز 80
3-8-1-2. تهیه بافر و محلولها 80
3-8-1-3. روش کار 81
3-8-1-4. استخراج پروتئینهای ترشحی 81
3-8-2. خالصسازی پروتئین 81
3-8-2-1. مواد مورد نیاز 81
3-8-2-1-1. آمادهسازی محلولها و مواد 81
3-8-2-1-2. روش کار ترسب پروتئینهای غشایی 83
3-8-2-1-3. ترسیب پروتئینهای ترشحی 83
3-8-2-2. تعیین غلظت پروتئینها 84
3-8-2-2-1. مواد مورد نیاز 84
3-8-2-2-2. آمادهسازی محلول برادفورد 85
3-8-2-2-3. روش کار 85
3-9. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید(تک بعدی) 85
3-9-1. مواد مورد نیاز 86
3-9-2. آمادهسازی مواد 86
3-9-3. روش کار 88
3-9-3-1. رنگآمیزی کوماسی بلو R-250 90
3-9-3-2. رنگآمیزی Blue Silver Staining 90
3-10. تصویر برداری و آنالیز ژلها 90
فصل چهارم- نتایج 91
4-1. جمعيت مورد مطالعه 92
4-2. درصد سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جمعآوری شده از بیماران با توجه به موضع جداسازی 93
4-3. مشاهده لام رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O 93
4-4. مشاهده لام رنگآمیزی ذیل-نلسون 94
4-5. نتایج کشتها 94
4-6. آزمونهای بیوشیمیایی وحساسیت آنتیبیوتیکی 95
4-7. نتایج تعیین غلظت پروتئینها 97
4-8. نتایج مربوط به تفکیک پروتئینها بر اساس وزن مولکولی 98
فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری 102
پیشنهاد 108
منابع 109
چکیده انگلیسی 117
فهرست نمودارها
2-1: ميزان بروز بيماري سل در طول 46 سال گذشته در ایران 41
4-1: نتایج کشت مثبت 92
4-2: منحنی استاندارد 98
فهرست جداول
2-1: تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس 15
2-2: داروهاي خط دوم درمان توبركلوزيس 32
2-3: تخمین موارد ومتوسط میزان بروز سل در جهان در سال2010 40
2-4: به تفکیک دانشگاههای علوم پزشکی کشور 42
2-5: برخی تغییرات ژنی در سویههای BCG M. bovis 47
3-1: نحوه گزارش میکروسکوپی 71
3-2: مواد تشکیلدهنده بافرتخلیص 81
3-3: مواد تشکیلدهنده محلول PBS x10 83
3-4: مواد تشکیلدهنده محلول برادفورد 85
3-5: مواد تشکیلدهنده Running Buffer 10% 86
3-6: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel stain 87
3-7: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel Destain 87
3-8: مواد تشکیلدهنده Fixation solution 87
3-9: مواد تشکیلدهنده Stainining solution 88
3-10: مواد تشکیلدهنده ژل 10%,12.5% Separating 89
3-11: مواد تشکیلدهنده ژل Stacking 5% 89
4-1: درصد نمونههای بالینی 93
4-2: نتایج تستهای بیوشیمیایی 96
4-3: نتایج تستهای حساسیت آنتیبیوتیکی و TCH 97
فهرست تصاویر
2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، بهدلیل بیماری سـل 11
2-2: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 16
2-3: کلنیهای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون 17
2-4: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 22
2-5: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال 2012 40
2-6: درخت تبارشناسی زیرسویههای مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آنها و خصوصیات مولکولی 46
2-7: برخی از عکسهای تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ 49
3-1: مرحله دیالیز 84
3-2: آمادهسازی صفحات شیشهای 88
4-1: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین 93
4-2: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون 94
4-3: فاکتور طنابی (cord factor) 95
4-4: تفسیر تست نیترات 95
4-5: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-250 99
4-6: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% رنگ آمیزی Blue Silver Staining 100
4-7: باندهای پروتئینهای ترشحی سویههای M. bovis و M. TB 101
5-1: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس 106
فصل اول
مقدمه
1-1. کلیات سل
سل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسانهای عصر حجر و استخوانهای مومیایی شده مصریان باستان جدا کردهاند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه يكي از بزرگترين مسائل بهداشتي جهان، بيماري سل است. حدس زده ميشود كه از هر سه نفر جمعيت جهان، يك نفر به باسيل سل آلوده بوده و درهر ثانيه يك نفر به تعداد آنان افزوده ميشود. نگران كننده اين است كه طبق برآوردهاي موجود 50 ميليون نفر از اين افراد، به باسيل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 ميليون نفر درجهان به بيماري سل مبتلا هستند كه بيش از 80% اين موارد، تنها مربوط به 22 كشور درحال توسعه جهان است.
در سال 2010 میلادی، حدود 8/8 ميليون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 ميليون نفر در اثر اين بيماري جان ميسپارند. بيش از 90% موارد بيماري و مرگ ناشي از سل در كشورهاي در حال توسعه رخ ميدهد، كشورهايي كه 75% موارد بيماري در آنها به فعالترين گروه سني به لحاظ اقتصادي (يعني 15 تا 54 سالگي) تعلق دارد.
آلودگي همزمان به ويروس ايدز خطر ابتلا به بيماري سل را به طور معنا داري افزايش ميدهد. كشورهاي با شيوع بالاي HIV، به ویژه كشورهاي واقع در افريقاي زير صحرا، شاهد افزايش چشمگير تعداد بيماران مبتلا به سل و افزايش 2 تا 3 برابر ميزانهاي بروز گزارش شده سل در دهه 90 بودهاند. در سال 2010، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).
سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی وخلط سینه بیماران میباشد. اما روشهای سرایت دیگری همچون تلقیح مستقیم باسیل سل در پوست مجروح کسانی که با بافت آلوده سروکار دارند نیز توصیف شده است. ورود باسیل سل به بدن یک فرد ضرورتا ایجاد بیماری سل نمیکند، اولین فاکتورهای افزایش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصیات شخصی هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسیت ژنتیکی)، عوامل اجتماعی (مانند فقر غذایی و شرایط زیستی) و عواملی نظیر سرکوب سیستم ایمنی ناشی از داروهای استروئیدی یا بیماریهایی نظیر سرطان خون، بیماریهای دستگاه رتیکولواندوتلیال، دیابت شیرین، بیماریهای قارچی سیستمیک و ایدز میباشد (Jonas V. et al., 1993).
کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس (MTB) که شامل مايکوباکتريوم توبرکلوزيس، افريکانوم، بوويس، بوويسBCG، کاپرهاي، ميکروتي(mycobacterium microti)، پنيپدي، dassie bacillusو کانتي (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصيات فنوتيپي متفاوتي در تستهاي بيوشيميايي از خود نشان ميدهند اما همولوژي بالايي به لحاظ ژنتيکي دارند .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضاي کمپلکس توبرکلوزيس براي پيشبرد درمان موفق ضروري است بالاخص در مناطقي که بيماري به صورت اپيدميک در ميآيد يا تماس انسان و حيوان زياد است .(Barouni A.S. et al., 2004)
همانطور که ذکر شد M. bovis یکی از قدیمیترین و مهمترین عامل بیماری سل بین انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب میشود. ميزان مرگ و مير ناشي از M. bovis بيشتر از M. tuberculosis ميباشد .(Majoor C.J. et al., 2011) تشخيص M. bovis و M. bovis BCG از ديگر اعضاي کمپلکس MTB بدليل مقاومت ذاتي (Scorpio A. et al., 1997) آنها به آنتي بيوتيک پيرازيناميد از اهميت راهبردي برخوردار است .(Jure´en P. et al., 2008)اين در حالي است که مقاومت به پيرازيناميد در مايکوباکتريومهاي غير کمپلکس MTB عموميت ندارد .(Sun Z. et al., 1997) پيرازيناميد جزو داروهاي خط اول مقابله با بيماري سل و قادر به از بین بردن باکتريهاي غیر فعال و احتمالا داخل سلولي است. اين خصوصيات امکان کاهش زمان درمان از ۱۲-۱۸ ماه به ۶ ماه را امکانپذير ميکند (Lee K.W. et al., 2001).
روشهاي کلاسيک افتراقM. tuberculosis و M. bovis و تستهاي حساسيت به دارو بر پايهي احياي نيترات، فعاليت آنزيم پيرازيناميداز (Pyrazinamide)، تجمع نياسين و رشد در محيط تيوفن ۲-کربوکسيليک اسيد هيدرازيد استوار است .(Monteros L. et al., 1998)
1-2. بیان مسئله
در حال حاضر سل بیش از سایر بیماریهای عفونی دیگر مانند مالاریا (Malaria)، ایدز و بیماریهای گرمسیری Tropical diseases)) در بین جمعیت بالای 5 سال تلفات دارد. طبق برآوردها در سال 2011، 7/8 میلیون مورد جدید سل (13% ابتلا مشترک با HIV ) دیده شد که 4/1 میلیون نفر در اثر ابتلا جان خود را از دست داده که از این تعداد سهم ابتلا مشترک با HIV 430000 نفر بوده است .(who., 2011) یک فاکتور مهم برای پیشرفت به توبرکلوزیس فعال در افراد با عفونت نهفته توبرکلوزیس میشود. عامل مرگ و میر در جهان در مقایسه با سرخک (با 2میلیون مرگ در جهان) و مالاریا (با یک میلیون مرگ در جهان) محسوب میگردد. بنابر گزارش سازمان بهداشت جهانی (W.H.O) و مرکز کنترل بیماریها در آمریکا (CDC) سل مسئول حدود 27% از موارد مرگ ومیر در سراسر جهان میباشد.
باتوجه به اینکه تنها راه محافظت از افراد سالم جامعه در برابر سل، ایمنیسازی، تشخیص سریع و درمان به موقع و کامل بیماران خواهد بود و نکته قابل توجه اینکه پیدایش سویههای M. tuberculosis مقاوم به آنتیبیوتیک و عدم کارایی واکسن BCG در بزرگسالان، تلاش برای دستیابی و گسترش ابزارهای تشخیص، پیشگیری و درمان سل یک ضرورت جهانی شده است .(Barker L.F. et al., 2009)
BCG تنها واکسن در دسترسی علیه توبرکلوزیس است که شامل یک خانواده هتروژنوس از یک زیر سویه با ژنوتیپ و فنوتیپ مشخص است. سازمان جهانی بهداشت عنوان کرده است که تشخیص زیرسویههای BCG در هر دو سطح ژنومیک (Genomic) و پروتئومیک (Proteomics) برای دستیابی به پاسخ ایمنی مناسبتر، لازم است .(Berredo-Pinho M. et al., 2011)
واكسنBCG نميتواند از عفونت M. tuberculosis جلوگيري كند ولي از فرمهایهاي شديد بيماري ممانعت ميكند. همچنين در افراد آلوده به M. tuberculosis، واكسيناسيونهاي بعدي با واكسن BCG باعث بالارفتن قدرت سيستم ايمني نميشود.
بیشتر آنتیژنهای مورد استفاده در واکسنهای نوترکیبBCG در پروتئینهایی به شدت غیر قطبی وجود دارند که خود این امر مسائلی را برای تولید این پروتئینها به منظور مصارف واکسن به همراه دارد .(Macedo G.C. et al., 2011)
در سال 1998،cole و همکاران، به تعیین توالی کامل ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوریسH37RV پرداختند و توانستد 3924 ژن منفرد را تعیین توالی کنند و به کمک این اطلاعات ژنتیکی مکمل، آنالیز پروتئوم به کمک ترکیبی از روشهای الکتروفورز دو بعدی و mass specterometry صورت گرفت (Britton W.J. et al., 1987). حدوداً 800 پروتئين ترشحي كد شونده توسط ژنوم M. tuberaulosis شناخته شده است.
در سال 1999،jungblut و همکاران از طریق مقایسه ژنتیکی به بررسی پروتئوم دو سویه غیر ویرولانس مایکوباکتریوم بوویس BCG(Chicago and Copenhagen) با دو سویه وحشی، M. tuberculosis (H37RV and Erdman) پرداختند تا از این طریق پروتئینهای مناسب برای توسعه دادن واکسن جدید تشخیص داده شود و در درمانهای جدید به کار رود. این سویهها به وسیلهSDS- page و الکتروفورز دوبعدی آنالیز شدند. ویژگیهای پروتئینها به وسیله طیفسنجی جرمی شناسایی و به وسیله پایگاه دادهای از الکتروفورز دو بعدی معرفی شد که 263 پروتئین مایع رویی کشت مایکوباکتریومی شناسایی شد. از این تعداد 54 مورد متعلق به سوپرناتانت کشت بوده، 16 پروتئین متفاوت از نظر شدت و موقعیت بین مایکوباکتریوم توبرکلوزیسH37RV وErdman و 25 پروتئین متفاوت از نظر شدت و موقعیت بین M. tuberculosis H37RV و M. bovis BCG شناسایی شد (Jungblut P.R. et al., 1999).
در سال 2003، Jens Mattow و همکاران، آنالیز فراگیر پروتئینهای سوپرناتانت کشتM. tuberculosis H37RV به کمک ترکیب روشهای الکتروفورز 2 بعدی، mass spectrometry و تعیین توالیN-terminal پرداختند. آنالیز ژل الکتروفورز دو بعدی حدود 1250 قطعه پروتئین را ازM. tuberculosis H37RV شناسایی شد. این مطالعه 137 پروتئین مختلف را نشان داد که 42 تا از آنها قبلاً به عنوان پروتئین ترشحی توضیح داده شده و از مقایسه پروتئوم ازM. tuberculosis H37RV و M. Bovis BCG Copenhagen ضعیف شده 39 تکه پروتئین مخصوصM. tuberculosis را نشان داد که دارای 27 پروتئین مختلف بودند که می تواند به عنوان کاندیدی از آنتیژنها برای تهیه واکسنی جدید باشد (Mattow J. et al. 2003). در بین پروتئینهای مشخص شده در پروتئوم مایکوباکتریومها، تعدادی هستند که بعنوان آنتیژنهای مایکوباکتریایی ارزش بالقوهای در تولید واکسن دارند و همچنین ارزش تشخیصی هم دارند. این پروتئینها شامل آلانیندهیدروژنازHsp60(RV0440) (RV2780)،Hsp70 (RV0350) ، اعضا کمپلکس آنتیژن85 کیلودالتونی، αکریستالین و آنتیژن35 کیلودالتونی از مهمترین موارد هستند. پروتئین34 کیلودالتونی بنام آنتیژن 84 در مایکوباکتریوم کانزاسی و بوویس BCG، مایکوباکتریوم لپره و M. tuberculosis وجود دارد .(Komiya K. et al., 2011 ; Farshadzadeh Z. et al., 2010)
1-3. اهمیت و ضرورت
چالشهاي زيادي در برابر توليد واكسن موثر برعليه سل وجود دارد. با مطالعات انجام شده تخمين زده ميشود که 3/1 جمعيت دنيا با M. tuberculosis آلودهاند. هر واكسن جديد بر عليه بيماري توبركلوزيس بايد جهت استفاده در جمعيت مناسب باشد. همچنين در افرادي كه خطر فعال شدن بيماري در آنها بسيار زيادتر است (مثل افراد آلوده به HIV كه با M. tuberculosis نيز آلودهاند)، واكسن جديد بايد بتواند به عنوان يك داروي محرك ايمني به همراه داروي پروفيلاكسي در پاكسازي بدن از باكتري موثر باشد.
مطلب قابل توجه دیگر اینکه افراد زیادی با BCG واكسینه شده اند، لذا هر واكسن موثر جديد بايد بتواند اين جمعيت بزرگ را كه با BCG واكسينه شدهاند را نيز در برابر عفونت توبركلوزيس محافظت كند (Martin C., 2005). همچنین تشخیص و درمان بموقع بیماری نیز از اهمیت خاصی برخوردار است.
تمامی چالشها محققان زيادي را در مراكز تحقيقاتي دنيا مشغول مطالعه استراتژيهاي جديد واكسيناسيون بر عليه توبركلوزيس کرده است تا بتوانند واكسني موثرتر از واكسن حال حاضر يعني BCG معرفي نمايند.
یکی از راه کارهای مناسب، بررسی پروفایل پروتئینی سویههای M. tuberculosis و M. bovis است، که مطالعهی پایلوت را به منظور تفاوت در الگوی پروتئینها بیان میکند.
آنالیز پروتئینی باکتریها بسته به روش جداسازی آنها اهمیت خاصی دارد. ترکیب خاص از روشهای مختلف از جمله SDS-page و الکتروفورز دوبعدی میتواند منجر به ارائه اطلاعات مفیدی درخصوص پروتئینهای اختصاصی باکتریها شود.