بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش SDS-PAGE

بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش  SDS-PAGE

بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس به روش SDS-PAGE

 

 

چکیده
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل میباشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال ۱۹۹۳، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوشهای مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مایکوباکتریوم بوویس به عنوان عامل سل گاوی به صورت موردی انسان را نیز درگیر می کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب میشود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتیژنهای باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شدهاند.
جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونههای ارسالی ۶ ماهه اول سال ۱۳۹۲ به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، ۱۰۰ نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونههای کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریومها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونیها در محیط میدل بروک ۷H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونیهای جدید، به منظور استخراج پروتئینهای ترشحی و غشایی از روشهای سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.
با بررسی باندهای حاصله از پروتئینهای غشایی و ترشحی در ۵ سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در ۵ سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئینهای غشایی باندهایی در محدوده ۱۵ تا ۸۵ کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از ۱۵ تا ۱۲۰ کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدودههای وزنی تقریبا ۳۰ تا ۱۱۶ کیلو دالتون بسیار متفاوت بودهاند.
در بررسی پروتئینهای ترشحی در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده ۱۵ تا ۱۱۵ کیلودالتون و در سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از ۱۸ تا ۱۱۴ کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدودهها مشاهده شد.
نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئینهای سویههای مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس میتواند مرجعی برای بررسیهای بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.
به نظر میرسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویههای حساس و بوویس با به کارگیری روشهای مناسب میتواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویههای حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.
فهرست مطالب
چکیده ۱
فصل اول- مقدمه ۳
۱-۱. کلیات سل ۴
۱-۲. بیان مسئله ۵
۱-۳. اهمیت و ضرورت ۷
۱-۴. اهداف ۸
فصل دوم- پیشینه تحقیق ۹
۲-۱. تاریخچه ۱۰
۲-۲. مایکوباکتریومها ۱۱
۲-۳. طبقهبندی مایکو باکتریومها ۱۲
۲-۳-۱. فتو کروموژن ۱۳
۲-۳-۲. اسکوتوکروموژن ۱۳
۲-۳-۳. غیر کروموژن ۱۴
۲-۳-۴. سریع الرشد ۱۴
۲-۴. باکتریولوژی سل ۱۴
۲-۵. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی ۱۵
۲-۶. خصوصیات رشد ۱۶
۲-۷ . فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ۱۷
۲-۷-۱. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی ۱۸
۲-۷-۲. انتقال توسط غشاء داخلی ۱۸
۲-۷-۲-۱. انتقال ترکیبات حاوی کربن ۱۸
۲-۷-۲-۲. انتقال ترکیبات غیر کربن ۱۹
۲-۸. فاکتورهای ویرولانس ۲۰
۱-۹. دیواره سلولی ۲۱
۲-۱۰. بیوشیمی دیواره سلولی ۲۳
۲-۱۱. بیماریزایی ۲۳
۲-۱۱-۱. مکانیسم بیماریزایی ۲۵
۲-۱۲. درمان سل ۲۶
۲-۱۲-۱. درمان سل حساس به دارو ۲۶
۲-۱۲-۲. درمان سل مقاوم به دارو ۲۶
۲-۱۳. مقاومت دارویی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ۲۷
۲-۱۴. مکانیسم مولکولی مقاومت دارویی ۲۸
۲-۱۴-۱. مقاومت به ریفامپین ۲۸
۲-۱۴-۲. مقاومت به ایزونیازید ۲۹
۲-۱۴-۳. مقاومت به پیرازین آمید ۲۹
۲-۱۴-۴. مقاومت به اتامبوتول ۳۰
۲-۱۴-۵. مقاومت به استرپتومایسین ۳۰
۲-۱۴-۶. فلورو کینولونها ۳۰
۲-۱۴-۷. آمینوگلیکوزیدها ۳۱
۲-۱۴-۸. سیکلوسرین ۳۱
۲-۱۴-۹. پاراآمینوسالیسیلیک ۳۲
۲-۱۵. انواع سل ۳۳
۲-۱۵-۱. سل ریوی ۳۳
۲-۱۵-۲. سل خارج ریوی ۳۳
۲-۱۵-۲-۱. سل عقدههای لنفاوی ۳۳
۲-۱۵-۲-۲. سل پلور ۳۴
۲-۱۵-۲-۳. سل استخوانی ۳۴
۲-۱۵-۲-۴. سل سیستم عصبی مرکزی ۳۴
۲-۱۵-۲-۵. سل شکمی ۳۴
۲-۱۵-۲-۶. سل دستگاه تناسلی ۳۵
۲-۱۵-۲-۷. سل پریکاردیت ۳۵
۲-۱۵-۲-۸. سل ارزنی ۳۵
۲-۱۶. سل در کودکان ۳۶
۲-۱۷. سل و ایدز ۳۶
۲-۱۸. روشهای تشخیص سل ۳۷
۲-۱۸-۱. تست پوستی ۳۷
۲-۱۸-۲. کشت ۳۷
۲-۱۸-۳. تهیه اسمیر ۳۸
۲-۱۸-۴. تکنیک PCR 38
۲-۱۸-۵. بررسی اینترفرون گاما ۳۸
۲-۱۸-۶. رادیوگرافی ریه ۳۹
۲-۱۹. اپیدمیولوژی ۳۹
۲-۱۹-۱. وضعیت بیماری سل انسانی در ایران ۴۱
۲-۲۰. مایکوباکتریوم بوویس ۴۴
۲-۲۰-۱. اهمیت سل گاوی ۴۵
۲-۲۱. مایکوباکتریوم بوویس ب.ث.ژ ۴۵
۲-۲۱-۱. فیلوژنی ۴۵
۲-۲۱-۲. تاریخچه BCG 48
۲-۲۱-۳. تاریخچه تولید و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ایران ۵۰
۲-۲۱-۴. ایمنیزایی ۵۱
۲-۲۱-۵. لزوم طراحی واکسن جدید ۵۲
۲-۲۲. پروتئومیکس مایکوباکتریومها ۵۳
۲-۲۳. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس ۵۸
فصل سوم- مواد و روشها ۶۱
۳-۱. نمونهگیری ۶۳
۳-۲. کشت و جداسازی باکتری ۶۴
۳-۲-۱. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان ۵/۱ لیتر ۶۴
۳-۲-۲. طرز تهیه محیط کشت ۶۴
۳-۲-۳. آلودگیزدایی و تغلیظ نمونهها ۶۵
۳-۲-۳-۱. آماده سازی محلولها ۶۶
۳-۲-۴. روش کار کشت ۶۶
۳-۲-۴-۱. محیط کشت حاوی تیوفن ۲- کربوکسیلیک اسید هیدرازید ۶۷
۳-۳. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریومها ۶۷
۳-۳-۱. تهیه گستره ۶۷
۳-۳-۲. رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O 68
۳-۳-۳. رنگآمیزی ذیل- نلسون ۶۹
۳-۳-۴. رنگآمیزی کینون (رنگآمیزی سرد) ۷۰
۳-۳-۵. بررسی و آزمایش گسترش ۷۱
۳-۴. بررسی لولههای کشت ۷۱
۳-۵. شناسایی و تعیین هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس ۷۲
۳-۵-۱. تست نیاسین ۷۷
۲-۵-۱-۱. معرفها و مواد لازم تست نیاسین ۷۲
۳-۵-۱-۲. آمادهسازی محلولها ی نیاسین ۷۲
۳-۵-۱-۳. مراحل کارتست نیاسین ۷۳
۳-۵-۲. آزمونهای احیای نیترات ۷۳
۳-۵-۲-۱. معرفها و مواد لازم تست نیترات ۷۳
۳-۵-۲-۲. آمادهسازی معرفهای تست نیترات ۷۴
۳-۵-۲-۳. مراحل انجام کار تست نیترات ۷۴
۳-۵-۲-۴. استانداردهای احیاء نیترات ۷۴
۳-۵-۳. تست کاتالاز ۷۵
۳-۵-۳-۱. محیط و مواد مورد نیاز ۷۶
۳-۵-۳-۲. آمادهسازی محلولهای تست کاتالاز ۷۶
۳-۵-۳-۳. مراحل انجام آزمایش روش نیمه کمی کاتالاز و کاتالاز ۶۸ درجه ۷۶
۳-۵-۳-۴. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز ۷۷
۳-۵-۴. حساسیت به تیوفن ۲- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH) 77
۳-۶. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریومها ۷۷
۳-۶-۱. تهیه محلول استاندارد مک فارلند ۷۸
۳-۶-۲. تهیه سوسپانسیون باکتری ۷۸
۳-۷. کشت سویههای انتخابی در محیط میدل بروک ۷H9 78
۳-۷-۱. مواد مورد نیاز ۷۸
۳-۷-۱-۱. آمادهسازی محیط ۷۸
۳-۷-۱-۲. انتحاب سویهها و کشت ۸۰
۳-۸. جمعآوری سویهها میکروبی، استخراج و خالصسازی پروتئین ۸۰
۳-۸-۱. استخراج پروتئینهای غشایی ۸۰
۳-۸-۱-۱. مواد مورد نیاز ۸۰
۳-۸-۱-۲. تهیه بافر و محلولها ۸۰
۳-۸-۱-۳. روش کار ۸۱
۳-۸-۱-۴. استخراج پروتئینهای ترشحی ۸۱
۳-۸-۲. خالصسازی پروتئین ۸۱
۳-۸-۲-۱. مواد مورد نیاز ۸۱
۳-۸-۲-۱-۱. آمادهسازی محلولها و مواد ۸۱
۳-۸-۲-۱-۲. روش کار ترسب پروتئینهای غشایی ۸۳
۳-۸-۲-۱-۳. ترسیب پروتئینهای ترشحی ۸۳
۳-۸-۲-۲. تعیین غلظت پروتئینها ۸۴
۳-۸-۲-۲-۱. مواد مورد نیاز ۸۴
۳-۸-۲-۲-۲. آمادهسازی محلول برادفورد ۸۵
۳-۸-۲-۲-۳. روش کار ۸۵
۳-۹. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید(تک بعدی) ۸۵
۳-۹-۱. مواد مورد نیاز ۸۶
۳-۹-۲. آمادهسازی مواد ۸۶
۳-۹-۳. روش کار ۸۸
۳-۹-۳-۱. رنگآمیزی کوماسی بلو R-250 90
۳-۹-۳-۲. رنگآمیزی Blue Silver Staining 90
۳-۱۰. تصویر برداری و آنالیز ژلها ۹۰
فصل چهارم- نتایج ۹۱
۴-۱. جمعیت مورد مطالعه ۹۲
۴-۲. درصد سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جمعآوری شده از بیماران با توجه به موضع جداسازی ۹۳
۴-۳. مشاهده لام رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O 93
۴-۴. مشاهده لام رنگآمیزی ذیل-نلسون ۹۴
۴-۵. نتایج کشتها ۹۴
۴-۶. آزمونهای بیوشیمیایی وحساسیت آنتیبیوتیکی ۹۵
۴-۷. نتایج تعیین غلظت پروتئینها ۹۷
۴-۸. نتایج مربوط به تفکیک پروتئینها بر اساس وزن مولکولی ۹۸
فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری ۱۰۲
پیشنهاد ۱۰۸
منابع ۱۰۹
چکیده انگلیسی ۱۱۷
فهرست نمودارها
۲-۱: میزان بروز بیماری سل در طول ۴۶ سال گذشته در ایران ۴۱
۴-۱: نتایج کشت مثبت ۹۲
۴-۲: منحنی استاندارد ۹۸
فهرست جداول
۲-۱: تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس ۱۵
۲-۲: داروهای خط دوم درمان توبرکلوزیس ۳۲
۲-۳: تخمین موارد ومتوسط میزان بروز سل در جهان در سال۲۰۱۰ ۴۰
۲-۴: به تفکیک دانشگاههای علوم پزشکی کشور ۴۲
۲-۵: برخی تغییرات ژنی در سویههای BCG M. bovis 47
۳-۱: نحوه گزارش میکروسکوپی ۷۱
۳-۲: مواد تشکیلدهنده بافرتخلیص ۸۱
۳-۳: مواد تشکیلدهنده محلول PBS x10 83
۳-۴: مواد تشکیلدهنده محلول برادفورد ۸۵
۳-۵: مواد تشکیلدهنده Running Buffer 10% 86
۳-۶: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel stain 87
۳-۷: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel Destain 87
۳-۸: مواد تشکیلدهنده Fixation solution 87
۳-۹: مواد تشکیلدهنده Stainining solution 88
۳-۱۰: مواد تشکیلدهنده ژل ۱۰%,۱۲.۵% Separating 89
۳-۱۱: مواد تشکیلدهنده ژل Stacking 5% 89
۴-۱: درصد نمونههای بالینی ۹۳
۴-۲: نتایج تستهای بیوشیمیایی ۹۶
۴-۳: نتایج تستهای حساسیت آنتیبیوتیکی و TCH 97
فهرست تصاویر
۲-۱: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، بهدلیل بیماری سـل ۱۱
۲-۲: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ۱۶
۲-۳: کلنیهای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ۱۷
۲-۴: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ۲۲
۲-۵: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال ۲۰۱۲ ۴۰
۲-۶: درخت تبارشناسی زیرسویههای مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آنها و خصوصیات مولکولی ۴۶
۲-۷: برخی از عکسهای تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ ۴۹
۳-۱: مرحله دیالیز ۸۴
۳-۲: آمادهسازی صفحات شیشهای ۸۸
۴-۱: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین ۹۳
۴-۲: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون ۹۴
۴-۳: فاکتور طنابی (cord factor) 95
۴-۴: تفسیر تست نیترات ۹۵
۴-۵: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل ۱۰% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-250 99
۴-۶: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل ۱۰% رنگ آمیزی Blue Silver Staining 100
۴-۷: باندهای پروتئینهای ترشحی سویههای M. bovis و M. TB 101
۵-۱: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس ۱۰۶
فصل اول
مقدمه
۱-۱. کلیات سل
سل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسانهای عصر حجر و استخوانهای مومیایی شده مصریان باستان جدا کردهاند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه یکی از بزرگترین مسائل بهداشتی جهان، بیماری سل است. حدس زده میشود که از هر سه نفر جمعیت جهان، یک نفر به باسیل سل آلوده بوده و درهر ثانیه یک نفر به تعداد آنان افزوده میشود. نگران کننده این است که طبق برآوردهای موجود ۵۰ میلیون نفر از این افراد، به باسیل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر ۱۲ میلیون نفر درجهان به بیماری سل مبتلا هستند که بیش از ۸۰% این موارد، تنها مربوط به ۲۲ کشور درحال توسعه جهان است.
در سال ۲۰۱۰ میلادی، حدود ۸/۸ میلیون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود ۱/۱ میلیون نفر در اثر این بیماری جان میسپارند. بیش از ۹۰% موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ میدهد، کشورهایی که ۷۵% موارد بیماری در آنها به فعالترین گروه سنی به لحاظ اقتصادی (یعنی ۱۵ تا ۵۴ سالگی) تعلق دارد.
آلودگی همزمان به ویروس ایدز خطر ابتلا به بیماری سل را به طور معنا داری افزایش میدهد. کشورهای با شیوع بالای HIV، به ویژه کشورهای واقع در افریقای زیر صحرا، شاهد افزایش چشمگیر تعداد بیماران مبتلا به سل و افزایش ۲ تا ۳ برابر میزانهای بروز گزارش شده سل در دهه ۹۰ بودهاند. در سال ۲۰۱۰، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان ۱۳% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).
سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی وخلط سینه بیماران میباشد. اما روشهای سرایت دیگری همچون تلقیح مستقیم باسیل سل در پوست مجروح کسانی که با بافت آلوده سروکار دارند نیز توصیف شده است. ورود باسیل سل به بدن یک فرد ضرورتا ایجاد بیماری سل نمیکند، اولین فاکتورهای افزایش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصیات شخصی هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسیت ژنتیکی)، عوامل اجتماعی (مانند فقر غذایی و شرایط زیستی) و عواملی نظیر سرکوب سیستم ایمنی ناشی از داروهای استروئیدی یا بیماریهایی نظیر سرطان خون، بیماریهای دستگاه رتیکولواندوتلیال، دیابت شیرین، بیماریهای قارچی سیستمیک و ایدز میباشد (Jonas V. et al., 1993).
کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB) که شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، افریکانوم، بوویس، بوویسBCG، کاپرهای، میکروتی(mycobacterium microti)، پنیپدی، dassie bacillusو کانتی (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصیات فنوتیپی متفاوتی در تستهای بیوشیمیایی از خود نشان میدهند اما همولوژی بالایی به لحاظ ژنتیکی دارند .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضای کمپلکس توبرکلوزیس برای پیشبرد درمان موفق ضروری است بالاخص در مناطقی که بیماری به صورت اپیدمیک در میآید یا تماس انسان و حیوان زیاد است .(Barouni A.S. et al., 2004)
همانطور که ذکر شد M. bovis یکی از قدیمیترین و مهمترین عامل بیماری سل بین انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب میشود. میزان مرگ و میر ناشی از M. bovis بیشتر از M. tuberculosis میباشد .(Majoor C.J. et al., 2011) تشخیص M. bovis و M. bovis BCG از دیگر اعضای کمپلکس MTB بدلیل مقاومت ذاتی (Scorpio A. et al., 1997) آنها به آنتی بیوتیک پیرازینامید از اهمیت راهبردی برخوردار است .(Jure´en P. et al., 2008)این در حالی است که مقاومت به پیرازینامید در مایکوباکتریومهای غیر کمپلکس MTB عمومیت ندارد .(Sun Z. et al., 1997) پیرازینامید جزو داروهای خط اول مقابله با بیماری سل و قادر به از بین بردن باکتریهای غیر فعال و احتمالا داخل سلولی است. این خصوصیات امکان کاهش زمان درمان از ۱۲-۱۸ ماه به ۶ ماه را امکانپذیر میکند (Lee K.W. et al., 2001).
روشهای کلاسیک افتراقM. tuberculosis و M. bovis و تستهای حساسیت به دارو بر پایهی احیای نیترات، فعالیت آنزیم پیرازینامیداز (Pyrazinamide)، تجمع نیاسین و رشد در محیط تیوفن ۲-کربوکسیلیک اسید هیدرازید استوار است .(Monteros L. et al., 1998)
۱-۲. بیان مسئله
در حال حاضر سل بیش از سایر بیماریهای عفونی دیگر مانند مالاریا (Malaria)، ایدز و بیماریهای گرمسیری Tropical diseases)) در بین جمعیت بالای ۵ سال تلفات دارد. طبق برآوردها در سال ۲۰۱۱، ۷/۸ میلیون مورد جدید سل (۱۳% ابتلا مشترک با HIV ) دیده شد که ۴/۱ میلیون نفر در اثر ابتلا جان خود را از دست داده که از این تعداد سهم ابتلا مشترک با HIV 430000 نفر بوده است .(who., 2011) یک فاکتور مهم برای پیشرفت به توبرکلوزیس فعال در افراد با عفونت نهفته توبرکلوزیس میشود. عامل مرگ و میر در جهان در مقایسه با سرخک (با ۲میلیون مرگ در جهان) و مالاریا (با یک میلیون مرگ در جهان) محسوب میگردد. بنابر گزارش سازمان بهداشت جهانی (W.H.O) و مرکز کنترل بیماریها در آمریکا (CDC) سل مسئول حدود ۲۷% از موارد مرگ ومیر در سراسر جهان میباشد.
باتوجه به اینکه تنها راه محافظت از افراد سالم جامعه در برابر سل، ایمنیسازی، تشخیص سریع و درمان به موقع و کامل بیماران خواهد بود و نکته قابل توجه اینکه پیدایش سویههای M. tuberculosis مقاوم به آنتیبیوتیک و عدم کارایی واکسن BCG در بزرگسالان، تلاش برای دستیابی و گسترش ابزارهای تشخیص، پیشگیری و درمان سل یک ضرورت جهانی شده است .(Barker L.F. et al., 2009)
BCG تنها واکسن در دسترسی علیه توبرکلوزیس است که شامل یک خانواده هتروژنوس از یک زیر سویه با ژنوتیپ و فنوتیپ مشخص است. سازمان جهانی بهداشت عنوان کرده است که تشخیص زیرسویههای BCG در هر دو سطح ژنومیک (Genomic) و پروتئومیک (Proteomics) برای دستیابی به پاسخ ایمنی مناسبتر، لازم است .(Berredo-Pinho M. et al., 2011)
واکسنBCG نمیتواند از عفونت M. tuberculosis جلوگیری کند ولی از فرمهایهای شدید بیماری ممانعت میکند. همچنین در افراد آلوده به M. tuberculosis، واکسیناسیونهای بعدی با واکسن BCG باعث بالارفتن قدرت سیستم ایمنی نمیشود.
بیشتر آنتیژنهای مورد استفاده در واکسنهای نوترکیبBCG در پروتئینهایی به شدت غیر قطبی وجود دارند که خود این امر مسائلی را برای تولید این پروتئینها به منظور مصارف واکسن به همراه دارد .(Macedo G.C. et al., 2011)
در سال ۱۹۹۸،cole و همکاران، به تعیین توالی کامل ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوریسH37RV پرداختند و توانستد ۳۹۲۴ ژن منفرد را تعیین توالی کنند و به کمک این اطلاعات ژنتیکی مکمل، آنالیز پروتئوم به کمک ترکیبی از روشهای الکتروفورز دو بعدی و mass specterometry صورت گرفت (Britton W.J. et al., 1987). حدوداً ۸۰۰ پروتئین ترشحی کد شونده توسط ژنوم M. tuberaulosis شناخته شده است.
در سال ۱۹۹۹،jungblut و همکاران از طریق مقایسه ژنتیکی به بررسی پروتئوم دو سویه غیر ویرولانس مایکوباکتریوم بوویس BCG(Chicago and Copenhagen) با دو سویه وحشی، M. tuberculosis (H37RV and Erdman) پرداختند تا از این طریق پروتئینهای مناسب برای توسعه دادن واکسن جدید تشخیص داده شود و در درمانهای جدید به کار رود. این سویهها به وسیلهSDS- page و الکتروفورز دوبعدی آنالیز شدند. ویژگیهای پروتئینها به وسیله طیفسنجی جرمی شناسایی و به وسیله پایگاه دادهای از الکتروفورز دو بعدی معرفی شد که ۲۶۳ پروتئین مایع رویی کشت مایکوباکتریومی شناسایی شد. از این تعداد ۵۴ مورد متعلق به سوپرناتانت کشت بوده، ۱۶ پروتئین متفاوت از نظر شدت و موقعیت بین مایکوباکتریوم توبرکلوزیسH37RV وErdman و ۲۵ پروتئین متفاوت از نظر شدت و موقعیت بین M. tuberculosis H37RV و M. bovis BCG شناسایی شد (Jungblut P.R. et al., 1999).
در سال ۲۰۰۳، Jens Mattow و همکاران، آنالیز فراگیر پروتئینهای سوپرناتانت کشتM. tuberculosis H37RV به کمک ترکیب روشهای الکتروفورز ۲ بعدی، mass spectrometry و تعیین توالیN-terminal پرداختند. آنالیز ژل الکتروفورز دو بعدی حدود ۱۲۵۰ قطعه پروتئین را ازM. tuberculosis H37RV شناسایی شد. این مطالعه ۱۳۷ پروتئین مختلف را نشان داد که ۴۲ تا از آنها قبلاً به عنوان پروتئین ترشحی توضیح داده شده و از مقایسه پروتئوم ازM. tuberculosis H37RV و M. Bovis BCG Copenhagen ضعیف شده ۳۹ تکه پروتئین مخصوصM. tuberculosis را نشان داد که دارای ۲۷ پروتئین مختلف بودند که می تواند به عنوان کاندیدی از آنتیژنها برای تهیه واکسنی جدید باشد (Mattow J. et al. 2003). در بین پروتئینهای مشخص شده در پروتئوم مایکوباکتریومها، تعدادی هستند که بعنوان آنتیژنهای مایکوباکتریایی ارزش بالقوهای در تولید واکسن دارند و همچنین ارزش تشخیصی هم دارند. این پروتئینها شامل آلانیندهیدروژنازHsp60(RV0440) (RV2780)،Hsp70 (RV0350) ، اعضا کمپلکس آنتیژن۸۵ کیلودالتونی، αکریستالین و آنتیژن۳۵ کیلودالتونی از مهمترین موارد هستند. پروتئین۳۴ کیلودالتونی بنام آنتیژن ۸۴ در مایکوباکتریوم کانزاسی و بوویس BCG، مایکوباکتریوم لپره و M. tuberculosis وجود دارد .(Komiya K. et al., 2011 ; Farshadzadeh Z. et al., 2010)
۱-۳. اهمیت و ضرورت
چالشهای زیادی در برابر تولید واکسن موثر برعلیه سل وجود دارد. با مطالعات انجام شده تخمین زده میشود که ۳/۱ جمعیت دنیا با M. tuberculosis آلودهاند. هر واکسن جدید بر علیه بیماری توبرکلوزیس باید جهت استفاده در جمعیت مناسب باشد. همچنین در افرادی که خطر فعال شدن بیماری در آنها بسیار زیادتر است (مثل افراد آلوده به HIV که با M. tuberculosis نیز آلودهاند)، واکسن جدید باید بتواند به عنوان یک داروی محرک ایمنی به همراه داروی پروفیلاکسی در پاکسازی بدن از باکتری موثر باشد.
مطلب قابل توجه دیگر اینکه افراد زیادی با BCG واکسینه شده اند، لذا هر واکسن موثر جدید باید بتواند این جمعیت بزرگ را که با BCG واکسینه شدهاند را نیز در برابر عفونت توبرکلوزیس محافظت کند (Martin C., 2005). همچنین تشخیص و درمان بموقع بیماری نیز از اهمیت خاصی برخوردار است.
تمامی چالشها محققان زیادی را در مراکز تحقیقاتی دنیا مشغول مطالعه استراتژیهای جدید واکسیناسیون بر علیه توبرکلوزیس کرده است تا بتوانند واکسنی موثرتر از واکسن حال حاضر یعنی BCG معرفی نمایند.
یکی از راه کارهای مناسب، بررسی پروفایل پروتئینی سویههای M. tuberculosis و M. bovis است، که مطالعهی پایلوت را به منظور تفاوت در الگوی پروتئینها بیان میکند.
آنالیز پروتئینی باکتریها بسته به روش جداسازی آنها اهمیت خاصی دارد. ترکیب خاص از روشهای مختلف از جمله SDS-page و الکتروفورز دوبعدی میتواند منجر به ارائه اطلاعات مفیدی درخصوص پروتئینهای اختصاصی باکتریها شود.
618 بازدید